Nextera - Illumina

Správná příprava knihovny je nezbytná pro vytvoření vysoce kvalitních sekvenačních dat. Efektivní protokol, který produkuje fragmenty DNA o vhodných vlastnostech a zároveň je široce využitelný, je nezbytný pro dosažení rovnoměrné distribuce čtení a minimalizaci neosekvenovaných úseků v získaných datech. Pracovní postup se skládá z řady po sobě jdoucích kroků, kdy každý vede k zvýšení celkové kvality sekvenovaných dat.

Technologie:

Pro přípravu knihovny se využívá speciální enzym, který štěpí DNA na fragmenty o vhodné délce pro sekvenování na přístrojích Illumina. Zároveň jsou konce fragmentů opatřeny oligonukleotidy, díky nimž se následně na každou stranu fragmentu váže jiný adapter s indexy. 

Dostupné kity:

Nextera XT DNA Sample Prep Kit

Nextera DNA Sample Prep Kit

Nextera Mate Pair Sample Prep Kit

Nextera Rapid Capture Exome and Expanded Exome Kits 

Nextera XT DNA Sample Preparation Kit

Nextera XT DNA Sample Preparation kit umožňuje přípravu knihoven pro sekvenaci na přístrojích Illumina. Hodí se zejména na přípravu knihoven malých genomů, amplikonů a plazmidů za méně než 90 minut a pouze 15 minutami ruční práce.

Technologie Nextera umožňuje v jednom kroku nafragmentovat DNA a opatřit fragmenty adapterovymi sekvencemi pomocí speciálně vyvinutého enzymu. Je možné sekvenovat i vzorky s nízkou počáteční koncentrací jako je 1 nanogram. Také je možné multiplexovat až 384 vzorků. Výhodou je i jednoduchá normalizace pomocí magnetických kuliček, díky které není potřeba další kvantifikace před smícháváním vzorků a samotným sekvenovaním.  

Dostupné kity

Dále potřeba objednat:

Nextera DNA Sample Prep Kit

Nextera  DNA Sample Preparation kit umožňuje přípravu knihoven pro sekvenaci na přístrojích Illumina. Hodí se zejména na přípravu knihoven velkých a komplexních genomů za méně než 90 minut a pouze 15 minutami ruční práce.

Technologie Nextera umožňuje v jednom kroku nafragmentovat DNA a opatřit fragmenty adapterovymi sekvencemi pomocí speciálně vyvinutého enzymu. Je možné sekvenovat i vzorky s nízkou počáteční koncentrací jako je 50 nanogram.  Je možné multiplexovat 96 vzorků. Výhodou je i jednoduchá normalizace pomocí magnetických kuliček, díky které není potřeba další kvantifikace před smícháváním vzorků a samotným sekvenovaním.  

Dále potřeba objednat:

Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit

Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit nabízí jedinou metodu pro připravení 12 kb mate pait knihoven bez použití gelu. Je to ideální postup pro de novo sekvenování, nalezení vhodných kontigů a detekci strukturálních variant. Knihovnu lze připravit z malého množství vstupní DNA a příprava trvá méně než dva dny. Lze si vybrat mezi gel free a gel plus protokolem. Kit spojuje technologie TruSeq a Nextera.

Nejdříve je genomová DNA nafragmentoaná pomocí speciálního Mate Pair Tagment enzymu. Zároveň jsou vzniklé fragmenty opatřeny biotynylovanými adaptery. Pomocí těchto adapterů se molekuly cirkularizují. Následuje mechanická fragmentace na menší fragmenty a pomocí streptavidinových kuliček jsou selektovány úseky s bitynylovanými adaptery, K fragmentům je přípojen adaptor s indexem nutný pro sekvenaci pomocí technologie TruSeq. 

Dále potřeba objednat:

Nextera Rapid Capture Exome and Expanded Exome Kits 

Nextera Rapid Capture Exome and Expanded Exome jsou kity umožňující jednoduše a efektivně osekvenovat exomy a identifikovat tak až 70% kódujících variant rychleji než jinými metodami a minimálními požadavky na množství vstupní DNA 50 ng.  Extended exome kit umoźňuje navíc sekvenovat i regulační oblasti (UTRs a miRNA). Srovnání obou kitů je uvedeno v tabulce níže.   

Genomová DNA je nejdříve pomocí enzymu nextera nafragmentována  a v dalším kroku opatřena adaptery s indexy. Ke vzorku jsou přidány biotynylované sondy specifické k vybraným exonům. Molekuly DNA s nahybridizovanou sondou jsou dále selektovány pomocí magnetických streptavidinových kuliček. Sekvenovat lze na všech přístrojích Illumina.

Dále potřeba objednat: